PAYLAŞ | YAZDIR | E-POSTA
Öncelikle, kamuoyu tartışmalarında sıklıkla gözden kaçan bir hatırlatma yapmak istiyorum: Covid mRNA aşıları gerçekten de yeni tıbbi ürünlerdir.
2020'deki acil durum onaylarından önce, mRNA aşı teknolojisi insanlarda büyük ölçekte hiç kullanılmamıştı. Bu platformu insanlarda test eden sadece iki klinik çalışma vardı; biri Pfizer-BioNTech'e, diğeri Moderna'ya aitti. Tıp tarihinde toplamda yaklaşık 37,000 kişi mRNA aşısı almıştı (kuduz, CMV ve kanser aşılarıyla ilgili daha küçük erken aşama çalışmalar hariç). Bu bir eleştiri değil; sadece bir gerçeğin ifadesidir. Ancak bu, bu ürünlerin uzun vadeli güvenlik profilinin tam olarak anlaşılmadığı ve hala anlaşılmadığı anlamına gelir.
Aşağıda anlatılanlar neredeyse tüm moleküler biyologlar için tanıdık gelecektir. Karmaşık olsa da, riskler göz önüne alındığında basitleştirmeye çalışıyorum. Herkes için moleküler çerçeveyi açıkça ortaya koymak önemlidir çünkü bu aşıların nasıl yapıldığı, şişenin içinde ne olduğunu doğrudan belirler.. Şişenin içindeki madde enjekte edildikten sonra vücutta dolaşarak uzun vadeli sağlık sorunlarına yol açabilecek bir dizi olayı tetikleyecektir.
In Vitro Transkripsiyon Sadece Bir Üretim Detayı Değildir
Modifiye mRNA aşıları, in vitro transkripsiyon (IVT) adı verilen bir işlem kullanılarak üretilir.)IVT, aşıdaki aktif bileşen haline gelen modifiye mRNA'yı sentezlemek için kullanılan yöntemdir.
Bu önemsiz bir teknik ayrıntı değil. IVT, nihai ürünün moleküler bileşimini temelden şekillendirir.
Pfizer aşısının geliştirilmesinde doğrudan yer alanlar da dahil olmak üzere BioNTech'teki bilim insanları ayrıntılı bir inceleme yayınladı.1 IVT reaksiyonlarının yalnızca amaçlanan tam uzunluktaki mRNA'yı değil, aynı zamanda bir dizi yan ürün ve safsızlığı da nasıl ürettiğini, bunların tipik olarak nasıl uzaklaştırıldığını ve kalıcı olmaları durumunda biyolojik sonuçlarının neler olabileceğini açıklıyor. Bu üretim talimatları ve oluşturdukları yan ürünler, Moderna tarafından patentlerinde (US10,653,712 B2 ve US10,077,439 B2) de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ancak daha da önemlisi, bu moleküler biyoloji Covid'den çok önce iyi bir şekilde ortaya konmuştu. Bunların hiçbiri spekülatif değil.
Başlangıç Maddesi: DNA Şablonları
Özünde, bir IVT reaksiyonu, istenen proteini kodlayan çift sarmallı DNA ile başlar. Bu durumda, SARS-CoV-2 diken proteini söz konusudur.
mRNA aşılarında kullanılan diken kodlayan dizi şudur: genetiği değiştirilmiş Stabiliteyi ve hücresel toleransı artırmak için, virüsün diken proteininden farklı kılan iki amino asit ikamesi de dahil olmak üzere çeşitli değişiklikler yapılmıştır. Bu değişiklik şudur: kasıtlı.
DNA şablonunun kendisi farklı biçimler alabilir. Pfizer'ın erken klinik denemelerinde PCR ile üretilen DNA parçaları kullanıldı. Bununla birlikte, ticari üretim süreci plazmitlerden elde edilen DNA'ya dayanıyordu. Bu önemlidir çünkü plazmitler ek düzenleyici diziler içerir. Pfizer örneğinde, bunlar arasında SV40 promotörü ve ori dizileri gibi unsurlar bulunur ve bunların insan hücrelerine girmesi endişe yaratır.
Bu DNA kalıbı, RNA polimeraz ve diğer bileşenlerle birlikte IVT reaksiyonuna eklendikten sonra, mRNA'ya dönüştürülür (Şekil 1).
IVT Tasarım Gereği Yan Ürünler ÜretiyorIVT'nin istenen çıktısı amaçlanan tam uzunlukta mRNA ürünü olsa da, gerçek çıktı daha karmaşıktır. Bunlar, (1) çift sarmallı RNA (dsRNA) dahil olmak üzere çeşitli RNA türleri, (2) RNA'ya bağlı DNA (RNA-DNA hibritleri) ve (3) orijinal şablondan gelen serbest DNA şeklinde çeşitli yan ürünleri içerir (Şekil 2).
Bu yan ürünlerin oluşumu iyi belgelenmiş ve kaçınılmazdır ve bu nedenle güvenlik açısından sonraki aşamalarda arıtma kesinlikle şarttır.
Şekil 2. IVT üretiminin yan ürünleri ve kirleticileri. Görsel, şu kaynaktan uyarlanmıştır: 1.Arıtmanın Bilinen Sınırlamaları Vardır
Üretimden sonra, önce DNA'yı, ardından da RNA yan ürünlerini uzaklaştırmak için iki arıtma adımı gereklidir (Şekil 3):
Şekil 3. IVT yan ürünlerinin uzaklaştırılması. Görüntü şu kaynaktan uyarlanmıştır: 2.DNA'yı uzaklaştırmak için reaksiyon karışımına DNase I adı verilen bir enzim eklenir; bu enzim genellikle bulaşıcı DNA'yı parçalamak için kullanılır. DNase I serbest kalıp DNA'ya karşı etkili olsa da, BioNTech bilim insanlarının kendi çalışmaları da dahil olmak üzere birçok çalışma, DNase I'in RNA'ya bağlı DNA'yı (RNA-DNA hibritleri) uzaklaştırmada etkisiz olduğunu göstermektedir.
Bu sınırlama tartışmalı değildir. Literatürde belgelenmiştir.
Bağımsız Analizlerin Gösterdikleri
Bu bağlam, bitmiş aşı şişelerine ilişkin yakın zamanda yapılan bağımsız analizlerin yorumlanması için çok önemlidir.
Araştırmacılar3 ve düzenleyiciler4 Yapılan testlerde, incelenen hemen hemen her şişede DNA kontaminantları tespit edildiği bildirilmiştir. Bu kontaminantlar arasında hem çift sarmallı DNA hem de DNase I sindirimine dirençli görünen RNA-DNA hibritleri yer almaktadır.
Bazı örneklerde, spike kodlayan DNA'nın seviyesi diğer plazmid dizilerine göre 100 kattan daha yüksekti.5Bu durum, sindirimin düzensiz veya eksik olduğunu düşündürmektedir. Dizileme ve kantitatif PCR analizleri ayrıca ortalama ~200 baz çifti uzunluğunda, bazıları 4 kilobazı aşan DNA parçalarını tespit etmiştir. Birkaç durumda, neredeyse tüm plazmidi kapsayan diziler gözlemlenmiştir.
Bu bulgular bir araya getirildiğinde, büyük ölçekli üretim sırasında saflaştırmanın tutarlılığı ve eksiksizliği ile insanlarda kalan nükleik asitlerin potansiyel biyolojik sonuçları hakkında ciddi soruları gündeme getiriyor.
Nükleik Asit Kirleticilerinin Biyolojik Açıdan Önemi
RNA ve DNA, doğuştan gelen bağışıklık yollarının güçlü aktivatörleridir. Bu spekülatif bir durum değildir. Desen tanıma reseptörleri ve cGAS-STING yolu, yabancı nükleik asitlere güçlü bir şekilde yanıt vererek iltihaplanmayı, büyüme inhibisyonunu ve hatta hücre ölümünü tetikler.
Bu mekanizmalar, gen terapisi ürünlerinin sıkı güvenlik denetimine tabi tutulmasının tam olarak nedenidir.
İronik bir şekilde, Covid mRNA aşıları, bu güçlü doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu azaltmak için özel olarak tasarlanmış modifikasyonlarla üretilmiştir. Ancak RNA-DNA hibritleri ve DNA parçaları, bu modifikasyonlara rağmen yine de güçlü bağışıklık tepkileri uyandıracaktır.
Israr, Yeni Soruları Gündeme Getiriyor
Aşılamadan sonra insan dokularında spike mRNA ve proteininin haftalar, aylar ve hatta yıllar boyunca varlığını sürdürdüğünü gösteren önemli kanıtlar mevcuttur (Tablo 1).
Bu kalıcılığın uzun süreli mRNA stabilitesini, devam eden translasyonu veya DNA tabanlı mekanizmaları yansıtıp yansıtmadığını henüz bilmiyoruz. Ancak DNA entegrasyonunun olasılığı ve kas hücrelerinde uzun ömürlü entegre olmamış plazmid DNA'nın varlığı göz önüne alındığında,6 Aşılamadan yıllar sonra Spike mRNA'sının, proteininin ve Spike'a karşı antikorların varlığını sürdürmesinin, IVT'yi takiben oluşan DNA safsızlıkları ve yan ürünleriyle ilişkili olduğunu varsaymak mantıksız değildir.
Tablo 1. İnsanlarda aşılama sonrası Spike mRNA ve proteininin kalıcılığıKısa ve Uzun Vadeli Güvenlik Etkileri
Bu veriler bir araya getirildiğinde, çeşitli önemli güvenlik hususlarını gündeme getiriyor.
İlk olarak, aşılama sonrasında sitokin fırtınası ve anafilaksi de dahil olmak üzere akut bağışıklık reaksiyonları bildirilmiştir. Özellikle nükleik asit kaynaklı bağışıklık aktivasyonu hakkında bilinenler göz önüne alındığında, bu tür güçlü inflamatuar yanıtların safsızlıklarla ilgisiz olduğu şeklinde tamamen göz ardı edilmemesi gerekir.
İkinci ve daha kritik olanı ise uzun vadeli risklerdir. Kalıcı diken ifadesi, kronik bağışıklık sendromlarına katkıda bulunabilir. Daha da endişe verici olan ise, insersiyonel mutasyon veya gen bozulması risklerini taşıyan DNA entegrasyonu olasılığıdır. Bu, DNA'nın nerede ve hangi yaşta entegre edildiğine bağlı olarak kanser veya gelişimsel kusurlar riski anlamına gelir.
Özellikle belirtmek gerekir ki, FDA kendi bilgilendirme broşürlerinde bu aşıların henüz etkili olmadığını ifade etmektedir. Kanserojenite (kanser oluşumu) veya genotoksisite (DNA hasarı) açısından değerlendirilmiştir; bu, uzun vadeli izlemenin standart olduğu gen terapisi gözetiminde rutin ve beklenen bir noktadır.
mRNA Aşılarında DNA ile İlgili Düzenleyici Boşluk
mRNA aşılarında artık DNA kalıntısı bulunduğuna dair hiçbir tartışma kalmadığına göre, asıl mesele mevcut kılavuzların ve güvenlik sınırlarının mRNA aşıları için uygun olup olmadığıdır. DNA yan ürünlerinin düzenleyici kılavuzlarda belirtilen sınırlar içinde olduğu konusunda bize güvence verildi. Peki, FDA'nın DNA yan ürünleri ve kirleticilerle ilgili kılavuzu nedir?
FDA'nın kalıntı DNA (doz başına ≤10 ng) ile ilgili en sık atıfta bulunulan kılavuzu, parçalanmış ve "çıplak" halde olan, insan hücrelerine girme yeteneği sınırlı olan canlı hücrelerde üretilen viral aşılar için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, mRNA aşıları hücrelerde üretilmez, kalıntı DNA'ları konakçı hücre kaynaklı değildir ve en önemlisi, mRNA aşılarındaki DNA çıplak değildir. Özellikle DNA'nın hücrelerin içine girmesini çok kolaylaştıran LNP dağıtım sistemleriyle ilişkilidir. FDA'nın 2010 kılavuzu, LNP tabanlı ürünlerle ilişkili DNA için ilgili bir güvenlik eşiği belirlemediğini açıkça belirtmektedir.
Diğer yaygın olarak atıfta bulunulan kılavuz ise, monoklonal antikorlar veya genetik olarak tasarlanmış hücrelerde üretilen hormonlar gibi ürünlerdeki artık DNA'yı ele alan rekombinant protein terapötikleri için DSÖ'den gelmektedir. Burada da artık DNA, konakçı hücrelerden veya ekspresyon plazmidlerinden kaynaklanır, eser miktarda, kapsüllenmemiş DNA (çıplak) olarak bulunur ve nihai ürün, nükleik asit bazlı bir terapi (mRNA aşısı) değil, saflaştırılmış bir proteindir. Dolayısıyla bu kılavuz mRNA aşıları için geçerli değildir.
Ne FDA ne de WHO'nun artık DNA için en sık atıfta bulunulan düzenleyici standartları değildi. mRNA aşıları için geliştirilmiştir ve bu güvenlik sorununu doğrudan ele almamaktadır.
Dünya Sağlık Örgütü'nün mRNA Aşıları Hakkındaki Açıklamaları — Uygulama Sonrası
2022 yılında Dünya Sağlık Örgütü, özellikle mRNA aşılarına yönelik bir kılavuz yayınladı.7Özellikle belirtmek gerekirse, bu belge yayınlandı. sonra Bu ürünlerin küresel çapta piyasaya sürülmesiyle ilgili olarak, bu kılavuzun özellikle şu hususlara yanıt olarak hazırlandığı belirtiliyor: “Bu yeni teknolojiyle ilgili güvenlik, üretim ve düzenleyici konular.Belgede ayrıca birkaç önemli ifade de yer almaktadır:
"Üretim yöntemlerine ilişkin ayrıntılı bilgiler henüz mevcut olmadığından, güvenli ve etkili mRNA aşıları için kontroller henüz standartlaştırılmadığından ve bazı ayrıntılar gizli tutulup kamuya açık olmadığından, şu anda özel uluslararası kılavuzlar veya tavsiyeler geliştirmek mümkün değildir.başlıklı bir kılavuz yayınladı
Ayrıca şu ifadeye yer verilmiştir:Ayrıntılı üretim ve kontrol prosedürleri... Ulusal Düzenleyici Kurum (NRA) ile görüşülmeli ve onaylanmalıdır.] Duruma göre bireysel olarak değerlendirilir.başlıklı bir kılavuz yayınladı
DSÖ, mRNA aşıları için kontrollerin henüz standartlaştırılmadığını ve belirli uluslararası kılavuzlar veya tavsiyeler oluşturmanın mümkün olmadığını kabul etmektedir. Ayrıca, ulusal yetkililer tarafından vaka bazında değerlendirme için düzenleyici denetim gereklidir.
Bu açıklama, mRNA aşılarının kullanıma sunulmasının ardından yapıldı..
Bu Substack yazısının yazıldığı an itibariyle, FDA henüz mRNA aşıları için standartlaştırılmış yönergeler oluşturmamış ve mRNA aşılarındaki DNA miktarına ilişkin herhangi bir sınırlamayı destekleyecek kanıt ve güvenlik temelli veri sunmamıştır.
Son olarak, tekrar etmekte fayda var: mRNA teknolojisi yeni olmasa da, Covid'den önce geleneksel bir aşı olarak değil, gen terapisi olarak düzenleniyordu. Covid aşılarındaki DNA yan ürünleriyle ilgili güvenlik sorunları, grip, RSV veya hatta kanser için geliştirilen mRNA aşıları da dahil olmak üzere herhangi bir mRNA aşısı için aynı olacaktır.
Çünkü mRNA ürünleri temelde farklıdır. Hücrelere girip onlara yabancı bir protein üretmeleri talimatını vermeleri gerekir. Bu, proteini doğrudan ileten diğer geleneksel aşılardan farklıdır. Bu platform için klinik bir emsal bulunmamaktadır ve tekrarlanan dozlama için de klinik bir emsal yoktur. Ve kesinlikle nüfus ölçeğinde bir emsal bulunmamaktadır.
Şu aşamada, pandemi olmamasına rağmen, biriken mekanistik veriler ve klinik gözlemler ile piyasaya sürülen mRNA aşı ürünlerinin çoğalması göz önüne alındığında, özellikle DNA yan ürünleriyle ilgili olarak bu ürünlerin üretimi için kritik yönergeler belirleyen FDA başta olmak üzere, düzenleyicilerden şeffaflık ve ciddi güvenlik çalışmalarıyla doğrudan etkileşim bekliyoruz.
Yeni teknoloji, sessizlik, manipülasyon veya sansür değil, yeni bir inceleme gerektirir.
Referanslar
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, ve diğerleri Mol Pharm. 2022 Nisan 4;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang ve ark. (2004) – “Kas içi enjeksiyon ve elektroporasyon sonrası plazmid DNA'nın konak genomik DNA'sına entegrasyonunun tespiti” (Gen Terapisi, 2004). Farelerde, çıplak plazmid DNA kas içine enjekte edildi ve ardından alımı artırmak için elektroporasyon uygulandı. Saflaştırılmış genomik DNA üzerinde (ekstrakromozomal formları uzaklaştırmak için jel ayırma ile) son derece hassas bir PCR kullanarak, yazarlar enjeksiyondan 4 hafta sonra dört bağımsız entegrasyon olayı tespit ettiler. Bağlantı dizilemesi, homolog olmayan uç birleştirmeyle tutarlı olarak rastgele entegrasyon bölgelerini (tercihli sıcak noktalar yok) doğruladı. Entegrasyon sıklığı düşüktü ancak ölçülebilirdi. Bu, kasta çıplak plazmid DNA için in vivo gerçek spontan entegrasyon olaylarının en açık gösterimlerinden biridir. Dikkat çekici olan – bu çalışma, LNP'ler yoluyla artırılmış iletimle karşılaştırılabilen elektroporasyon yoluyla artırılmış DNA iletimini kullandı.
Martin ve ark. (1999) – “Plazmid DNA Sıtma Aşısı: Kas İçi Enjeksiyondan Sonra Genomik Entegrasyon Potansiyeli” (İnsan Gen Terapisi). Bu önceki çalışma, farelerde kas içi plazmid DNA'yı test etti ve entegrasyonu araştırmak için yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA üzerinde Southern blot hibridizasyonu ve PCR kullandı. Kalıcılık çoğunlukla kromozom dışı olsa da, bazı örneklerde nadir entegrasyonu düşündüren kanıtlar bildirdiler (ancak daha sonraki çalışmalarda olduğu kadar kesin olarak dizilenmedi). Düşük risk için bir ölçüt belirledi, ancak çok düşük sıklıkta olaylar için potansiyeli kabul etti ve bu da daha sonraki FDA DNA aşıları kılavuzunu etkiledi.
Ledwith ve ark. (2000) – “Plazmid DNA aşıları: Farelerde kas içi enjeksiyon sonrası konak hücre DNA'sına entegrasyonun incelenmesi” (Intervirology). Farelere kas içine enjekte edilen çıplak plazmid DNA'nın, tespit edilebilir bir entegrasyon gözlenmemesine rağmen, 26 haftaya kadar kuadriseps kasında DNA'nın hala tespit edildiğini gösterdi. DNA, kromozom dışıydı.
7 DSÖ Biyolojik Standardizasyon Uzman Komitesi 74. Raporu Ek 3. Bulaşıcı hastalıkların önlenmesi için haberci RNA aşılarının kalitesi, güvenliği ve etkinliğinin değerlendirilmesi: düzenleyici hususlar https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
Dr. Charlotte Kuperwasser, Tufts Üniversitesi Tıp Fakültesi Gelişimsel, Moleküler ve Kimyasal Biyoloji Bölümü'nde seçkin bir profesör ve Tufts Yakınsama Laboratuvarı'nın direktörüdür. Dr. Kuperwasser, meme bezi biyolojisi, meme kanseri ve önlenmesi alanındaki uzmanlığıyla uluslararası alanda tanınmaktadır. Ayrıca, Bağışıklama Uygulamaları Danışma Kurulu üyesidir.
